1.本发明涉及一种人工筋膜及其构建方法与应用，人工属于生物复合材料技术领域。筋膜及
背景技术：
2.疝（hernia）是构建男性老龄人群常见临床外科疾病，通常采用生物补片进行治疗。应用但现有技术中的流程生物补片存在抗张强度低的不足之处，往往因抗张强度过低而导致降解太快，人工从而过早失去其支架功能，筋膜及导致疝气复发。构建因此，应用有必要研发一种抗张强度高的流程生物材料。
3.盆腔器官脱垂（pelvic organ prolapse，人工pop）是筋膜及多因素疾病，为骨盆底结缔组织和肌肉组织支撑功能减弱从而导致盆腔器官脱出于阴道内或阴道外，构建是应用盆底功能障碍（pelvic floor dysfunction pfd）的一种症状。pop严重影响中老年女性生活质量和身心健康。流程通常使用网片植入修复进行治疗。然而以聚丙烯网片为代表的化学合成网片虽然在机械性能及成功率方面表现出优越性，但因其不可降解性及组织相容性差引起的阴道壁侵蚀、慢性疼痛、感染及性交不适等问题不容忽视，其并发症引起二次手术的发生率高于自身组织修复手术引起二次手术的发生率。因此，有必要研发一种组织相容性高、免疫性能好的生物材料。
技术实现要素：
4.针对上述现有技术，本发明提供了一种人工筋膜，以及其构建方法，以及其在作为治疗疝气的生物补片中的应用，在作为治疗盆腔器官脱垂的网片中的应用。
5.本发明是通过以下技术方案实现的：一种人工筋膜，是由脂肪干细胞负载羊膜、prp凝胶和聚氨酯膜组成的具有5层结构的复合材料，5层结构的材料依次为：脂肪干细胞负载羊膜，prp凝胶，聚氨酯膜，prp凝胶，脂肪干细胞负载羊膜；所述脂肪干细胞负载羊膜是铺有脂肪干细胞的脱细胞羊膜。
6.进一步地，所述prp凝胶的厚度为0.2～0.4 mm，优选0.3 mm。
7.进一步地，所述聚氨酯膜的厚度为0.2～0.4 mm，优选0.3 mm。
8.进一步地，所述脂肪干细胞负载羊膜是通过以下方法制备得到：将脂肪干细胞接种到脱细胞羊膜上，生长7～14天，即得。具体操作方式为：将脱细胞羊膜平铺在培养板上，接种含有脂肪干细胞的培养液，然后将脱细胞羊膜翻转，在脱细胞羊膜的另一面上接种含有脂肪干细胞的培养液；培养7～14天，即得。
9.进一步地，所述脱细胞羊膜，可通过以下方法制备得到：（1）取新鲜的羊膜，浸泡于初步消毒溶液中，对羊膜进行初步消毒，并抑制细菌生长；所述初步消毒溶液，为含有50 μg/ml青霉素、50 μg/ml链霉素和2.5 μg/ml两性霉素的pbs溶液；（2）取出羊膜，用无菌水清洗，再用次氯酸钠溶液清洗，再用无菌水清洗；清洗过程
中可进行摇床震荡，羊膜会随晃动而充分展开，清洗效果更佳；（3）将清洗后的羊膜浸入冻存溶液中，捞出置于滤纸上，充分展开，再覆盖一层滤纸，反复冻融两次；所述冻存溶液是由甘油和dmem培养基按体积比1:1混合而成的；所述反复冻融两次的具体操作为：置于-80℃环境下冻存1小时，然后置于37℃环境下融化0.5小时，再置于-80℃环境下冻存1小时，然后置于37℃环境下融化0.5小时；（4）将反复冻融后的羊膜置于triton x-100溶液中，摇床孵育，初步去除细胞；然后用pbs溶液震荡清洗羊膜；（5）将羊膜置于脂肪酶溶液中，摇床孵育，以充分去除上皮细胞及其他杂质，然后用pbs溶液震荡清洗羊膜；所述脂肪酶为购自索莱宝生物科技公司的脂肪酶 type ii l8070；脂肪酶溶液的浓度为1000 u/l；（6）将羊膜置于京尼平水溶液中，交联，蒸馏水冲洗；将羊膜置于饱和甘氨酸溶液中，浸泡，换液至溶液不再变色，蒸馏水反复冲洗；将羊膜置于铝箔上，254 nm紫外线照射；将羊膜平铺在硝酸纤维膜上，绒毛膜面朝向硝酸纤维膜，压在铁盘下，置于-40℃环境下冷冻10～15小时；（7）将冷冻的羊膜冷冻干燥至含水量为5%～7%；（8）将干燥的羊膜裁剪，装入塑料袋中真空密封，γ射线辐照灭菌。
10.进一步地，所述脂肪干细胞，可通过以下方法制备得到：（1）脂肪干细胞的分离：取采集的脂肪组织，用生理盐水洗涤；加入适量ⅰ型胶原酶溶液或胰蛋白酶溶液，消化；过滤，离心；吸弃细胞沉淀上层的油脂和酶溶液；用生理盐水重悬细胞沉淀，吹散，细胞过滤网，离心，吸弃上清液，得到基质血管组分细胞（stromal vascular fraction，svf）；（2）脂肪干细胞的培养与传代：上述分离得到的基质血管组分细胞，进行常规培养，细胞融合度达到70%～80%时可以传代培养；收集p2或p3代细胞，进行冻存，备用。
11.进一步地，所述洗涤的具体操作方式为：将脂肪组织置于容器（比如t175培养瓶）中，先吸取（用移液管吸取）上层黄色油脂，弃掉，再吸取下层红色液体，弃掉；向剩余的脂肪组织中加入适量生理盐水，剧烈晃动3 min，以充分洗涤脂肪组织，静置3～5 min，吸弃下层水相；重复洗涤脂肪组织三次，直至下层水相液清澈。
12.进一步地，所述消化的具体操作方式为：加入酶溶液后，封口膜封口，剧烈晃动5～10 s，置于气浴恒温震荡器中，在37℃、70 rpm条件下，消化60 min，消化过程中每隔15 min剧烈晃动5～10 s。
13.进一步地，所述prp凝胶，最好是自体prp凝胶，以避免排异反应、过敏反应等。
14.进一步地，所述prp凝胶中含有50 ng/ml的白介素10和30 ng/ml的巨噬细胞迁移抑制因子。
15.所述聚氨酯膜，是现有技术中已有的常规产品，可市场购买得到。
16.所述人工筋膜的构建方法，包括以下步骤：（1）将脂肪干细胞负载羊膜平铺在平皿底部，在其上平铺一层prp凝胶；
（2）将聚氨酯膜平铺在上述prp凝胶上；（3）在上述聚氨酯膜上面平铺一层prp凝胶；（4）将另一块脂肪干细胞负载羊膜平铺在上述prp凝胶上，即得人工筋膜。
17.所述人工筋膜在作为或制备治疗疝气的生物补片中的应用，在作为或制备治疗盆腔器官脱垂的网片中的应用。
18.本发明的人工筋膜，以聚氨酯膜为核心，以免疫性源性低的羊膜为覆盖物，同时为了使两者紧密结合，使用了prp凝胶作为粘附材料。本发明在prp凝胶中添加了两种炎症抑制因子，由于植入体内有免疫细胞的浸入，尤其是中性粒细胞释放的各类酶，可以加速植入物的降解，通过炎症抑制因子的加入，可以延缓人工筋膜在体内的停留时间，以便自身细胞的爬入与定植，随着成纤维细胞的植入，胶原蛋白的分泌，机体自身的再生能力得以激活并逐渐替代移植物。本发明的人工筋膜，抗张强度高，组织相容性好，具有良好的免疫功能，可降解，是一种性能优异的生物复合材料，可用于治疗疝气、盆腔器官脱垂，应用潜力巨大。
附图说明
19.图1：脱细胞羊膜的he染色结果示意图。
20.图2：脂肪干细胞（原代细胞）形貌示意图。
21.图3：脂肪干细胞（p2代细胞）形貌示意图。
22.图4：脂肪干细胞负载羊膜的he染色结果示意图。
23.图5：人工筋膜、正常筋膜及脱细胞羊膜的he染色结果示意图。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
25.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
26.实施例1脱细胞羊膜的制备（1）取新鲜的人羊膜，浸泡于初步消毒溶液中，浸泡时间20分钟，对羊膜进行初步消毒，并抑制细菌生长；所述初步消毒溶液为含有50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素和2.5μg/ml两性霉素的pbs溶液；（2）取出羊膜，用无菌水震荡清洗（4次，每次10分钟），再用浓度为0.05%的次氯酸钠溶液震荡清洗（次氯酸钠灭活病毒，对羊膜无损伤；10分钟），再用无菌水震荡清洗（4次，每次10分钟）；（3）将清洗后的羊膜置于冻存溶液中，捞出置于滤纸上，充分展开，再覆盖一层滤纸，置于-80℃环境下冻存1小时，然后置于37℃环境下融化0.5小时，再置于-80℃环境下冻存1小时，然后置于37℃环境下融化0.5小时（即反复冻融2次）；所述冻存溶液是由甘油和dmem培养基按体积比1:1混合而成的；
（4）将反复冻融后的羊膜置于1%的tritonx-100溶液中，37℃摇床（转速80rpm/min）孵育24小时，初步去除细胞；然后用pbs溶液震荡清洗羊膜（10分钟）；（5）将羊膜置于1000u/l的脂肪酶溶液中，37℃摇床（转速80rpm/min）孵育15小时，以充分去除上皮细胞及其他杂质，还能保证羊膜结构的完整，保留了羊膜中的生长因子，占羊膜中生长因子总含量的75%；然后用pbs溶液震荡清洗羊膜（3次，每次10分钟）；所述脂肪酶为购自索莱宝生物科技公司的脂肪酶typeiil8070；（6）脱细胞羊膜的交联：将羊膜置于0.5%京尼平水溶液中，20℃交联24h，蒸馏水冲洗；将羊膜置于饱和甘氨酸溶液中，浸泡，换液至溶液不再变色，蒸馏水反复冲洗；将羊膜置于铝箔上，距离254nm紫外灯6寸高度，照射2h；将羊膜平铺在硝酸纤维膜上，（绒毛膜面朝向硝酸纤维膜），压在铁盘下，置于-40℃环境下冷冻12小时；（7）将冷冻的羊膜在-30℃、0.2mbar的环境下冷冻干燥至含水量为6%（约6小时），此时羊膜达到较佳的脱水状态，在后续进行γ射线灭菌时不会产生自由基；（8）将干燥的羊膜裁剪后装入塑料袋中真空密封，γ射线（钴60）辐照灭菌。
27.上述制备的脱细胞羊膜，进行he染色（具体的染色方法为常规的实验方法），染色结果如图1所示，由图1可见，脱细胞羊膜富含丰富的胶原组织，且表面无细胞。
28.实施例2脂肪干细胞的制备（1）脂肪干细胞的分离
①
采集脂肪组织：用肿胀液局部浸润麻醉供脂肪组织区域，以20ml注射器配备口径1.5～3.5mm、侧孔3.0～5.0mm的吸脂针，进入供区，形成负压，呈“扇形”手动均匀吸取脂肪组织150ml；所述肿胀液是由以下组分组成的：生理盐水250ml，2%利多卡因溶液10～15ml，肾上腺素0.25mg。
29.采集前，对提供脂肪组织的供者的健康状况进行全面检查（如一般信息、既往病史和家族性遗传病等）及病原微生物的感染筛查和在危险疫区停留情况的调查。要求：身体状态良好、有完整体检报告、无遗传性家族病史、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及无血液系统疾病；血常规及分类、肝肾功能正常；人源性特定病毒（包括hiv、hbv、hcv、htlv、ebv、cmv等）阴性、梅毒螺旋体阴性。供者在提供脂肪组织的同时，另需提供不少于8ml外周血用于复检、abo血型、hla
‑ⅰ
类和ⅱ类分型检查，以备追溯性查询。
30.②
取采集的脂肪组织，用生理盐水洗涤：将100ml抽取的脂肪装入脂肪采集瓶中，取50ml脂肪分装到一个t175培养瓶中；用10ml移液管，去吸头，先吸取t175培养瓶上层黄色油脂弃掉，再吸取下层红色液体弃掉；向t175培养瓶中加入100ml生理盐水，剧烈晃动3min，充分洗涤脂肪组织，静置5min，吸去下层水相；重复洗涤脂肪组织操作三次，直至下层水相液清澈，记录t175培养瓶中剩余洗涤脂肪组织的终体积。
31.加入等体积的ⅰ型胶原酶溶液（浓度0.05%，质量百分数），消化60min；无菌输血器滤网过滤，400g离心10min；吸弃细胞沉淀上层的油脂和酶溶液；用生理盐水重悬细胞沉淀，吹散，细胞过100目滤网，400g离心10min，吸弃上清液，得到基质血管组分细胞（svf）。
32.所述消化的具体操作方式为：加入酶溶液后，封口膜封口，剧烈晃动5～10s，置于
气浴恒温震荡器中，在37℃、70rpm条件下，消化60min，消化过程中每隔15min剧烈晃动5～10s。
33.（2）脂肪干细胞的培养与传代
①
原代培养：使用10ml无血清培养体系重悬上述制备的基质血管组分细胞，细胞吹散后，补加8ml无血清培养体系；将细胞平均接种到3个t-75培养瓶中，每个培养瓶均补加无血清培养体系4ml；将培养瓶水平放入37℃、5%二氧化碳的培养箱中，进行常规培养。
34.所述无血清培养体系是由无血清培养液（lonza，12-725f）和无血清添加剂（pall，15950-017）组成的，二者的体积比为50:1。
35.②
细胞换液：原代培养24h后，进行全量换液；此后，每隔3天全量换液一次，放置在二氧化碳恒温恒湿（37℃，95%湿度）培养箱中，进行5%二氧化碳的常规细胞培养。
36.③
细胞收集：培养到第8天时，原代培养细胞融合度达到80%～90%时，消化收获细胞：将培养瓶中的无血清培养体系收集到50ml规格的离心管中，离心处理10min（室温，400g）；用20ml的生理盐水清洗t-75培养瓶1次，倒掉生理盐水，在t-75培养瓶中加入37℃预热的0.25%的胰酶2ml；在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆，并脱落漂浮，即用离心后的无血清培养体系终止消化，消化过程在37℃条件下，消化时间4min；将终止的细胞悬液收集到一个50ml离心管中，用10～20ml的生理盐水清洗一遍t-75培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中，300g离心处理10min，弃上清，吹散离心后的细胞沉淀，加生理盐水稀释至40ml，300g离心10min，得到细胞沉淀。
37.对细胞做质量检测和性能指标检测（包括细菌、支原体、内外源病毒、细胞活力、细胞鉴别、生长特性、细胞纯度、均一性及内毒素等）。
38.原代细胞，传代细胞（p2）的形貌如图2、图3所示。
39.④
冻存：用1.5ml无血清培养体系稀释步骤上述得到的细胞沉淀，混合均匀；缓慢加入在4℃条件下预冷30min的冻存液1.5ml，混合均匀；将3ml混合均匀后细胞悬液加入到3个冻存管中，每管1ml；使用程序降温仪冷冻（降温至-80℃，90min）细胞，再放入液氮罐保存（-196℃），备用。
40.所述冻存液是由20%（体积百分数）的dmso（sigma，d5879）和80%的无血清培养体系组成的。
41.实施例3脂肪干细胞负载羊膜的制备（1）将脱细胞羊膜平铺在六孔板中，调整脂肪干细胞培养液（实施例2的原代细胞），使其接种密度为1
×
104/ml，接种到脱细胞羊膜上，0.5ml/cm2，放置到培养箱中，37℃、5%二氧化碳培养1h。
42.（2）使用无菌镊子将脱细胞羊膜翻转过来，向脱细胞羊膜的另一面接种脂肪干细胞培养液1ml/cm2，放置到培养箱中，37℃、5%二氧化碳培养1h。
43.（3）在二氧化碳培养箱中37℃、5%二氧化碳培养7天，即得脂肪干细胞负载羊膜。中间换液一次。取一小块脂肪干细胞负载羊膜，进行he染色，如图4所示，由图4可见，脱细胞羊膜没有细胞成分，在脱细胞羊膜表面可见染成蓝核的细胞，说明脂肪干细胞在脱细胞羊膜表面生长。
44.实施例4自体prp凝胶的制备（1）严格按照无菌要求采集外周血50ml，使用专用血袋（已包含抗凝剂）采集血
液，采集过程中，边采集边缓慢上下摇晃血袋，以防止凝血。采集前，需要患者提供传染病检测报告，包括甲肝、乙肝、丙肝、戊肝、hiv、梅毒，确保患者传染病检测的真实性和准确性。
45.（2）在生物安全柜内，将外周血转移到离心管中，550g，10min，rt离心，收集上层富含血小板的血浆。
46.（3）重离心（2000g，15min），调整血小板浓度到合适水平（2
×
109/ml），加入凝血酶（蓬莱诺康药业，h20041419）及葡萄糖酸钙(上海浦津林州制药有限公司,h41022648)（prp/激活剂9:1）,另加白介素10（义翘神州，il0-h5219）50ng/ml，巨噬细胞迁移抑制因子（novusbiological，美国，f60103h011）30ng/ml，3min之内形成凝胶。
47.实施例5人工筋膜的构建（1）将脂肪干细胞负载的脱细胞羊膜（2cm
×
4cm）（羊膜的厚度约为0.02～0.5mm）平铺在平皿底部，使用注射器吸取prp凝胶（凝固前），去掉针头，在脱细胞羊膜上面平铺一层prp凝胶（0.3mm），等待3min凝固。
48.（2）将聚氨酯膜（厚度约为0.3mm，2cm
×
4cm）平铺在上述prp凝胶上。
49.（3）使用注射器吸取prp凝胶（凝固前），去掉针头，在聚氨酯膜上面平铺一层prp凝胶（0.3mm），等待3min凝固。
50.（4）将另一块脂肪干细胞负载的脱细胞羊膜（2cm
×
4cm）平铺在prp凝胶上，即得人工筋膜，其由5层材料构成，依次为：脂肪干细胞负载羊膜，prp凝胶，聚氨酯膜，prp凝胶，脂肪干细胞负载羊膜。
51.生物力学检测：用生物材料力学测试机探头对上述制备的人工筋膜拉伸并达到平衡，此时标本长度即为测试起始高度。以速率对标本进行10次连续拉伸，每次拉伸速率为0.084cm/min。纵向应力与纵向应变的比例常数就是材料的弹性模量。以脱细胞羊膜为对照。结果如表1所示。
52.表1分组标本个数弹性模量（mpa）脱细胞羊膜52.67
±
0.36人工筋膜51.29
±
0.28由表1可见，脱细胞羊膜较人工筋膜的弹性模量大，说明由于细胞成分的加入，人工筋膜较柔软并坚韧，接近于体内的筋膜组织。
53.动物实验：12只新西兰大白兔（2月龄，体重1.5～2kg）随机分为2组，每组6只。第一组为脱细胞羊膜组，第二组为人工筋膜组，动物麻醉，大白兔取侧俯卧位，沿背部中线切开皮肤，彻底止血，充分暴露背部筋膜，切除10mm
×
10mm大小的筋膜，可吸收缝线将相应大小的脱细胞羊膜或人工筋膜分别缝合固定在缺损处，缝合张力达到完全对合为宜。术后14天、60天分别采用空气栓塞法处死每组实验动物，取背部植入部位组织行组织学检查，如图5所示。
54.由图5可见，术后14天两组均可见较多炎细胞浸润，术后60天，人工筋膜组较脱细胞羊膜组炎性细胞浸润减少，筋膜胶原纤维形态结构良好，胶原纤维间有较多成纤维细胞长入，仅植入物边界有少量炎性细胞浸润。
55.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将
在所附权利要求的范围内。