1.本发明属于微流控芯片技术领域，用于异质养及具体涉及异质性细胞培养及监测的性细芯片微流控芯片及其制备方法。
背景技术：
2.细胞异质性(heterogeneity)是胞培广泛存在于细胞系统中的现象，与干细胞分化和癌症等疾病的监测及发生和预后紧密相关。在同一组织中获取的流控细胞样本，细胞之间的制备基因组可能相同，但其形态学、用于异质养及行为学和基因表达等方面存在着显著差异。性细芯片然而，胞培传统基于细胞群体的监测及研究方法通常只得到一群细胞的平均值，忽视了细胞间的流控差异性，这给疾病机制探究和精准治疗带来了巨大挑战。制备
3.肿瘤异质性是用于异质养及指肿瘤在发生发展进程中，由于多次增殖，性细芯片子细胞与母细胞之间产生分子生物学或基因方面的胞培改变，继而导致肿瘤在生长速度、侵袭能力、药物敏感性、术后生存期以及患者预后等方面产生差异
1.。肿瘤异质性包括空间和时间上的异质性，前者指同一肿瘤在不同区域存在差异，后者指原发肿瘤与复发、继发转移性肿瘤之间的差异。肿瘤异质性被认为是导致高死亡率和药物抵抗的重要原因之一，异质性程度越高，药物治疗效果和患者预后越差
2.。因此，了解肿瘤异质性对肿瘤的临床诊断、个性化治疗和预后监测等方面具有重要价值。
4.然而，目前临床上肿瘤诊断依赖于组织活检技术进行小范围内的肿瘤特征评估，无法代表患者整体肿瘤；同时，术后对切除肿瘤取样时，通常只关注肿瘤内的恶性部分，忽视了对具有侵袭性和异质性区域的检测，无法及时准确评估肿瘤对不同治疗手段的敏感性和监测预后。此外，肿瘤的时间异质性需要在不同发展阶段进行观察和检测，然而组织活检属于侵入性有创检查，无法多次进行。
技术实现要素：
5.本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用于异质性细胞培养及相互作用监测的微流控芯片及其制备方法，为个性化精准治疗、药物敏感性、疾病进展监测以及新药开发提供一种新型高通量仿生平台。
6.本发明采用微流控芯片技术，在体外建立三维仿生的共培养体系，对异质性肿瘤细胞进行长时程、高活力、高通量培养，实现多细胞相互作用的实时动态观察，监测不同亚型肿瘤细胞在功能特征、药物敏感性、发生发展速度和转移潜力等方面的差异。
7.微流控芯片，又称芯片实验室，是一种以微米尺度空间对流体进行操控的技术，可以将化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测，细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成到一块芯片上。
8.本发明提供的用于异质性细胞培养及相互作用监测的微流控芯片微流控芯片，采用聚二甲基硅氧烷(pdms)作为基片材料，具有良好的光学特性、绝缘性、热稳定性和生物相容性。将其预聚物和聚合剂以(8-15):1混合后倒在光刻图案化模板上，固化形成pdms基片，
然后通过等离子体处理将pdms基片与玻璃片键合，制备适用于异质性细胞培养及相互作用监测的微流控芯片。上述微流控芯片具有多单元集成的特点，通过增加单元数，可研究患者来源的肿瘤组织中细胞群体的异质性，用于开展药物筛选和个性化治疗。
9.本发明提供的异质性细胞培养及相互作用监测的微流控芯片，由pdms基片和玻璃片键合组成；其中，pdms基片上设计有多个功能单元以一定形式组合形成复合结构，每个功能单元均设有：灌注通道、凝胶通道、火山型毛细被动阀、肿瘤细胞通道；参见图1所示。其中：
10.所述灌注通道，用于灌注各种类型培养用液体，例如培养基、细胞悬液、药物溶液；该灌注通道的结构为：以呈弧形(如半圆弧形)管腔结构为一个单元，有n个单元依次连通，形成连续的闭合通道，为各个功能单元提供相同流体环境；灌注通道设有两个进样口，用于连接灌注系统，实施对灌注通道灌注各种类型流体；
11.所述凝胶通道，用于灌注各种粘度的凝胶和细胞形成的凝胶混合液；其中，凝胶由亲水性聚合物链交联形成，可以形成三维网络结构，为细胞生长提供三维支架，同时为氧气、营养物质和代谢废物的扩散和交换提供支持，起到细胞外基质的作用；凝胶通道有n个，每个凝胶通道两端开设独立进样口；凝胶通道主体为弧形管腔结构，一侧紧贴灌注通道，另一侧紧贴肿瘤细胞通道；弧形管腔内壁两侧均匀排布有若干个弧边梯形柱，形成弧边梯形柱阵列，相邻两个弧边梯形柱之间形成火山型毛细被动阀，利用“接触角滞后现象”改变局部的毛细力方向，控制液体流动，进而将凝胶状物质有效限制在凝胶通道内，实现长期的细胞独立培养；相比传统的直线型被动阀，火山型毛细被动阀稳定性更强，可适应更大范围不同粘度的水凝胶以及不同流速的灌注，极大程度减少了传统设计中因水凝胶进样阻滞或流速过快导致的毛细被动阀破裂；同时，火山型毛细被动阀可应用于细胞界面生物学的观察与研究，扩大了被动阀的应用范围；
12.所述肿瘤细胞通道，有n个，分别排布在n个凝胶通道内侧，一端为扇形结构，以火山型毛细被动阀为界与凝胶通道相隔，一端为进样口，用于灌注细胞悬液；各功能单元的肿瘤细胞通道相互独立，互不影响，每个肿瘤细胞通道为一个单独的反应池。
13.本发明中，每个芯片上可集成功能单元数n至少为3，通常为3-8，或更多。
14.本发明中，多个功能单元共用同一灌注通道，便于快速高通量灌流培养，减少重复操作。
15.本发明中，多个功能单元的肿瘤细胞通道相互独立，互不影响，每个肿瘤细胞通道为一个单独的反应池。
16.本发明中，每个单元肿瘤通道为扇形结构，扇形半径50-4000μm，弧度30
°‑
300
°
，高度10-200μm。
17.本发明中，每个单元灌注通道、凝胶通道为弧形管腔结构，通道宽度50-4000μm，高度10-200μm。
18.本发明中，弧边梯形柱上底长度10-850μm,下底长度20-1000μm，下底长度大于上底长度，上下底之间宽度10-200μm；优选为上底300-500μm，下底350
ꢀ‑
600μm，上下底之间宽度40-65μm。更优选为上底400μm，下底550μm，上下底之间宽度55μm。
19.本发明中，弧边梯形柱之间形成的火山型毛细被动阀上底间距5-100μm，下底间距10-200μm，下底间距大于上底间距，弧线角度α范围90
°‑
180
°
。优选为上底间距20-50μm，下
底间距80-130μm，弧线角度90
°
至124
°
。更优选为上底间距30μm，下底间距110μm，弧线角度108
°
。
20.本发明提供的多细胞异质性相互作用微流控芯片的制备方法，具体步骤如下：
21.(1)用光刻法制作微流控芯片结构图案硅片模板，包括旋涂光刻胶、软烘焙、紫外曝光、后烘、显影、坚膜、硅烷化处理等步骤；
22.(2)将聚二甲基硅氧烷(pdms)预聚物与聚合剂以质量比为(8-15):1的比例混合搅拌，离心去除气泡；
23.(3)将混合离心好的pdms浇筑于图案化硅片模板上，抽真空排除气泡后，转移至80℃烘箱加热直至pdms固化；
24.(4)将固化的pdms芯片从模板上切割取出，根据需求打进样孔；
25.(5)通过等离子体处理或者利用夹具将pdms芯片和玻璃片紧密贴合，确保液体不渗漏。
26.本发明多细胞异质性相互作用的微流控芯片，其使用时的操作流程为：
27.(1)将制备好的微流控芯片置于80℃烘箱24h，恢复通道内的疏水性；
28.(2)芯片使用前，紫外照射1h灭菌；
29.(3)将凝胶溶液从凝胶通道进样口注入凝胶通道，待凝胶凝固后，在灌注通道内灌注培养用液体；
30.(4)将细胞悬液从肿瘤细胞通道进样口通入肿瘤细胞通道，根据需要预先在通道内修饰不同比例的聚乙二醇(peg)和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(rgd)以改变通道基底黏附性。
31.本发明提供的本发明提供的多细胞异质性相互作用微流控芯片可用于异质性细胞培养及相互作用监测，具体如下：
32.(1)本发明可用于不同细胞间的三维仿生共培养，通道间能实现初始时相对独立，但营养物质、细胞因子等小分子互通；连续的灌注培养过程中可以不断地提供新鲜的培养基，为细胞长时程培养提供稳定的环境，同时可以连续收集培养基液体，用于下游组学分析等；
33.(2)本发明完美适配高分辨率显微成像系统，可实现快速动态、高分辨率的细胞间相互作用监测；配合活细胞培养系统(如okolab)，对细胞和亚细胞甚至大分子层次进行多通道、多标记的荧光或明场全面扫描，实现对动态过程的六维(x，y，z，时间，多波长，多位置)实时记录和观察，获得全面的细胞互作信息；
34.(3)结合芯片连续灌注和实时动态成像，本发明可对异质性细胞统一灌注干扰因子或治疗药物，长时程监测和评估不同亚型细胞对同一干预物的反应；高效准确地捕捉细胞、组织的动态变化，实现对不同细胞的识别、定位、跟踪和图像分割等，进一步量化分析和比较异质性细胞间的相互作用；
35.(4)本发明可集成传感器对细胞进行无介入性、无破坏性的动态持续监测；通过将芯片与电传感器相偶联，监测芯片上总体的阻抗反映细胞相互作用过程中阻抗值变化，捕获细胞互作的异质性；也可偶联荧光生物传感器，如荧光染料、荧光探针和纳米颗粒等，监测各种蛋白、代谢物、mrna的发光强度、反射指数和入射/反射光角度变化来实现分子层面的动态监测。
36.本发明的异质性细胞培养及相互作用监测的微流控芯片设计具有如下特点：
37.(1)芯片上设计的弧边梯形柱之间能形成稳定的火山型毛细被动阀，利用“接触角滞后现象”改变局部的毛细力方向,从而控制液体流动，实现芯片内细胞界面的稳定构建以及长期独立的细胞培养；
38.(2)设计中火山型毛细被动阀的弧线角度α自90
°
至124
°
范围有较好效果，能有效分散凝胶通道内的液体压力，满足更大范围内各种粘度的凝胶能平稳、匀速地充满整个凝胶通道，确保毛细被动阀不破裂；
39.(3)肿瘤通道的低黏附预处理可满足肿瘤细胞芯片上自发成球的需求，提供更为仿生的三维肿瘤组织结构；
40.(4)连通的灌注通道方便培养基和药物溶液的灌注，减少重复操作；
41.(5)本发明微流控芯片可用于多细胞相互作用异质性分析，功能单元式的设计可重复集成组合，比传统单一结构的微流控芯片更能满足高通量的需求。
42.本发明设计的微流控芯片具有如下优点：
43.(1)兼容性强、成本低廉、生物相容性好、操作简便；
44.(2)可实现不同细胞、类器官、组织的共培养，用于研究其相互作用，相较于其他共培养体系，该发明更接近于体内微环境，具有动态实时观测、生物相容性好、样本量少的优势；
45.(3)功能单元可重复增加、排列组合，满足细胞异质性分析的需求：
46.针对肿瘤空间异质性，可以在芯片上进行药物筛选，优化不同肿瘤区域的用药策略，增强治疗靶向性；
47.针对肿瘤时间异质性，可以在芯片上长时程、高活力培养肿瘤细胞，实时动态观察肿瘤生长、扩散和转移的全过程，预测肿瘤进展速度和转移潜力，辅助医生开展更为准确的预后评估和制定相应干预措施；
48.(4)该芯片可用于开展肿瘤内不同细胞亚型迁移能力以及诱导血管出芽能力的量化和比较，能够有效区分强迁移和弱迁移能力的肿瘤细胞，并从异质性肿瘤细胞群体中分离出特定迁移能力的细胞亚群，为个性化医疗和药物筛选提供可能；
49.(5)该芯片可用于研究癌症治疗的免疫评分，通过与免疫细胞共培养获得更详尽的化疗反应倾向，提出基于肿瘤免疫微环境相互作用模式的分类标准，为指导癌症个性化治疗提供理论依据；
50.(6)优化形成的火山型毛细被动阀稳定可靠，重复性好，适用于各种粘度的凝胶。
附图说明
51.图1为六个功能单元组合形成的异质性细胞培养及相互作用监测的仿生微流控芯片结构图示。
52.图2为单个功能单元内各部分结构。
53.图3为低黏附表面处理的微流控芯片上，肿瘤细胞自发形成的肿瘤球。
54.图中标号：1为灌注通道；2为凝胶通道；3为弧边梯形柱；4为肿瘤细胞通道；5为火山型毛细被动阀。
具体实施方式
55.下面结合实例和附图，对本发明做进一步说明。
56.实施例1，一种肿瘤类器官和自组装血管网络相互作用的微流控芯片，包括六个功能单元(参见图1)，每个单元设计有灌注通道、凝胶通道、弧边梯形柱、肿瘤细胞通道。其中凝胶通道内通入纤维蛋白原(3mg/ml)和内皮细胞的混合液诱导其自组装形成微血管网络。然后在细胞通道内修饰聚乙二醇peg 3h(0.5mg/ml)，使其形成疏水性表面，通入同一患者肿瘤组织不同位置的肿瘤细胞悬液(细胞密度：1.5
×
106个/ml)，24h后肿瘤细胞自发形成球形肿瘤类器官，此后球体不断规则化，150h左右球体最为规则，直径240μm，球体紧实(图3)。实时监测肿瘤类器官与血管网络之间的相互作用，对比分析不同单元肿瘤类器官的迁移能力与诱导血管新生的能力，随后加入药物进行干预，评估药物对于不同亚型肿瘤细胞的影响。
57.本发明提供的异质性肿瘤类器官和自组装血管网络相互作用的微流控芯片制备方法，具体步骤如下：
58.(1)采用autocad软件对芯片的微通道结构进行绘制和设计，用光刻法制备带有设计微图案的硅模板，步骤包括有旋涂光刻胶、软烘焙、紫外曝光、后烘、显影、坚膜、硅烷化处理；具体操作为：均匀旋涂一层光刻胶su-8 2050于硅片上(1700rpm)，然后将硅片依次置于65℃加热台5min，95℃加热台25min完成软烘焙步骤；待硅片冷却后，将带有设计图案的菲林胶片置于光刻胶上方，紫外曝光30s；再将硅片依次置于65℃加热台5min，95℃加热台10min完成后烘步骤；随后将硅片置于显影液中显影9min；显影完的硅片上可见清晰的由光刻胶固化形成的图案，再将硅片置于150℃热台上坚膜30min；最后用三甲基氯硅烷对硅片和光刻胶表面进行硅烷化处理；
59.(2)将聚二甲基硅氧烷(pdms)预聚物与聚合剂以质量比为10:1的比例混合搅拌，离心去除气泡；
60.(3)将混合离心好的pdms浇筑在硅板上，再通过真空泵抽真空去除气泡后，置于80℃烘箱1h使pdms固化；
61.(4)将固化冷却后的pdms芯片从硅模板上取下，打孔器打直径2mm的进样孔；
62.(5)通过等离子体处理后将亲水表面pdms芯片和玻璃片键合，随后将整块微流控芯片置于80℃烘箱24h，恢复通道内的疏水性；
63.(6)芯片使用前，紫外照射1h灭菌。
64.一般地，肿瘤的空间和时间异质性，临床常需要多点多次取样，然后对单个样品分别进行分子生物学分析，整个过程成本高、耗时长、误差大且不利于患者恢复。使用本发明设计的微流控芯片对多细胞进行培养、检测分析。每个单元是一个单独的反应室，可以对同一患者不同部位的肿瘤细胞进行长时程的检测分析。已知肿瘤异质性是导致药物治疗失效的重要原因，不同亚型细胞的药物敏感性不同，因此在各单元内可以对患者异质性肿瘤细胞开展药物筛选，获得肿瘤不同区域的最佳用药策略，增强药物的靶向性实现精准治疗。其次，对异质性肿瘤细胞的长时程培养可以预测肿瘤的生长扩散速度以及其转移潜力，有利于患者的预后评估和及时调整治疗策略等。此外，肿瘤异质性研究可以指导新药的开发，根据不同亚型肿瘤细胞的分子特征和代谢方式不同，研发靶向药物和相应的治疗方案，实现个性化分层治疗。
65.本发明微流控芯片，具有良好的生物相容性、操作简单、易于观察，匹配大多数成像系统，包括有光学显微镜、体式显微镜、激光共聚焦显微镜、双光子显微镜、全内反射荧光显微镜等。相比于传统细胞共培养transwell法，本发明能更好的模拟体内的三维环境和流体状态。在本发明芯片上能够诱导内皮细胞自组装形成可灌注的直径不同的血管网络，实时动态观察血管网络生成过程以及肿瘤类器官与血管网络之间的相互作用。此外，相比于手动转移肿瘤球至通道，通过peg修饰通道自发形成肿瘤球的过程更加简单，并减少转移过程中可能对肿瘤球造成的损伤。本发明在肿瘤定性分级、指导个性化治疗策略的制定、药物筛选评价和患者预后的早期预测中具有广阔的应用前景。
66.参考文献
67.[1]de sousa emf,vermeulen l,fessler e,et al.cancer heterogeneity
‑‑
a multifaceted view[j].embo rep,2013,14(8):686-695.
[0068]
[2]burrell ra,swanton c.tumour heterogeneity and the evolution of polyclonal drug resistance[j].mol oncol,2014,8(6):1095-1111。