技术领域：
：1.本发明属于化学/生物传感
技术领域：
：，种基具体涉及一种基于多肽复合膜修饰电极的于多l-谷氨酸检测方法及传感器。
背景技术：
：：2.l-谷氨酸(l-谷氨酸tamate，肽复l-谷氨酸)，合膜作为最常见的修饰氨基酸，通常以其钠盐的电极的形式即谷氨酸钠存在，作为食品添加剂为人们所知。种基但是于多，l-谷氨酸在神经系统中也发挥着重要作用。肽复它由神经细胞释放，合膜负责在神经细胞之间发送信号。修饰神经元兴奋性水平取决于l-谷氨酸的电极的相对平衡。这种平衡的种基任何改变都可能导致几种神经或精神疾病。l-谷氨酸浓度偏高可导致兴奋毒性损伤和突触功能障碍，于多包括焦虑、肽复抑郁、偏头痛/头痛和疼痛。l-谷氨酸浓度偏低也会导致生理功能障碍，如滑石症、肌萎缩性侧索硬化症和阿尔茨海默病。此外，大脑和血液中l-谷氨酸浓度失衡会引起一系列神经退行性疾病。总的来说，准确测定体液中谷氨酸浓度对多种癌症以及神经性疾病的预防和治疗具有重要意义。因此，开发一种快速、灵敏检测l-谷氨酸的方法，在生命科学和营养健康领域是十分必要的。3.目前，检测谷氨酸的方法有氨基酸分析仪、高效液相色谱(hplc)、毛细管电泳以及一系列基于酶或者无机材料的电化学传感器。例如lin等制备了一款基于谷氨酸脱氢酶的传感器，利用谷氨酸脱氢酶只与l-谷氨酸反应，从而将d-谷氨酸与l-谷氨酸区别开来。alam等利用二氧化钌与谷氨酸的特异反应制备了一款基于无机材料的传感器。然而，传统方法需要昂贵的设备、耗时的样品制备和熟练的操作人员。基于酶的传感器因酶易于失活且价格昂贵。基于无机材料的传感器对生物体通常是有害的不能直接用于体液检测。4.近年来，由于多肽能模拟蛋白质的多种结构和功能特征，且多肽易于合成与修饰、成本低、易于保存、有良好的稳定性，基于多肽的电化学传感器逐渐应用于蛋白质、抗原等生物分子的检测。zhao等使用二茂铁(fc)功能化螺旋肽测定酶活性前列腺特异性抗原(psa)，其电化学测量原理是在psa存在下电极表面发生溶蛋白性裂解，导致电流信号下降；该电极制备简单，具有良好的选择性，检测下限为0.2ng/ml。yang等筛选出对双酚a(bpa)表现出特异性的七肽，自组装于金电极表面，随着捕获的bpa分子的增多而响应峰电流下降，线性响应范围为1～5000nm，检测下限为0.7nmol/l。hwang等将noro-1肽固定在金电极表面上，可应用于人类诺如病毒的检测，重现性与稳定性好，检测下限为99.8nmol/l。然而迄今为止，基于多肽复合膜用于检测l-谷氨酸的无酶电化学传感器尚未见报道。技术实现要素：5.本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于多肽复合膜修饰电极的l-谷氨酸检测方法及传感器。6.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：一种基于多肽复合膜修饰电极的l-谷氨酸检测方法，所述l-谷氨酸的检测方法包括如下步骤：7.步骤一：合成二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷(fc-p16peptide)；所述二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷结构式如式(i)所示：[0008][0009]步骤二：制备fc-peptide/aue多肽复合膜修饰电极：将金电极于超纯水中浸泡，然后抛光，洗净并吹干；将预先配置好的16.0μmol/l的二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷溶液与10.0μmol/l的三(2-羧乙基)膦溶液混匀，室温下静置1h后移液枪移取6.0μl混合溶液，滴加于金电极表面，4℃孵育8h；再将金电极6-巯基-1-己醇浓度为10.0μmol/l的6-巯基-1-己醇溶液中浸泡120min；移液枪移取5％的nafion溶液7.0μl滴加于电极表面，室温自然风干后，用pbs沿着金电极表面缓慢冲洗以除去非特异性吸附的其它物质，吹干即得fc-peptide/aue多肽复合膜修饰电极；[0010]步骤三：以fc-peptide/aue多肽复合膜修饰电极为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，构成三电极体系；然后采用循环伏安法、电化学阻抗谱法和差分脉冲伏安法考察不同修饰电极的电化学行为，并采用差分脉冲伏安法对不同浓度的l-谷氨酸进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的l-谷氨酸进行检测。[0011]在一个优选的实施方式中，步骤二中对金电极表面进行抛光是分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极表面进行抛光。[0012]在一个优选的实施方式中，步骤二中所述金电极直径为3mm。[0013]在一个优选的实施方式中，步骤三是在1mmol/l磷酸盐缓冲溶液、10.0mmol/l[fe(cn)6]4-/3-‑0.1mol/lkcl溶液、含有1.0×10-3mol/ll-谷氨酸的1mmol/l磷酸盐缓冲溶液中采用循环伏安法、电化学阻抗谱法和差分脉冲伏安法考察不同修饰电极的电化学行为，采用差分脉冲伏安法对不同浓度的l-谷氨酸进行电流响应与浓度关系测试；循环伏安法参数为：采样间隔0.001v，扫速50mv/s。电化学阻抗谱法参数为：频率范围：0.1hz-10000hz,开路电压；0.23496v,振幅：0.005mv。差分脉冲伏安法参数为：振幅0.05v，脉冲周期0.5s，抽样宽度0.02，脉冲宽度0.05s。[0014]一种基于多肽复合膜修饰电极的l-谷氨酸检测传感器，所述传感器包括作为工作电极的多肽复合膜修饰电极；所述多肽复合膜修饰电极包括金基质(5)，所述金基质(5)表面修饰有多肽复合膜层(6)，所述多肽复合膜层(6)中含有多肽分子(7)，所述二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷分子的氨基酸序列为ggggiilqenaqgggg，两端的-gggg-为连接序列(linker)。[0015]在一个优选的实施方式中，所述多肽分子(7)为二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷分子。[0016]在一个优选的实施方式中，所述多肽复合膜层(6)中还含有6-巯基-1-己醇分子(8)。[0017]在一个优选的实施方式中，所述多肽复合膜层(6)中还含有nafion分子。[0018]在一个优选的实施方式中，所述金基质(5)的厚度为1.0～5.0mm，所述多肽复合膜层(6)的厚度为2～20nm。[0019]在一个优选的实施方式中，所述传感器对l-谷氨酸的浓度存在良好的线性关系，检测的线性范围为1.0×10-7～1.0×10-3mol/l，检出限为1.0×10-7mol/l。[0020]二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷在制备生物传感器中的应用。所述二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷结构式如式(i)所示：[0021][0022]本发明首先筛选出了l-谷氨酸特异性肽序列iilqenaq，基于此序列，以两端的-gggg-为连接序列(linker)，合成了两端分别具有二茂铁与1,2-二硫代环戊烷-3-正丁基残基侧链的二茂铁功能化多肽，即，二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷(fc-p16peptide)，其中含有碳链骨架桥—(ch2)4—，其氨基酸序列如图所示。该肽末端具有二硫基团，还原剂三(2-羧乙基)膦(tcep)的加入打断了二硫键而形成两个硫醇基团，硫醇基团能在金电极表面通过au-s键结合，从而避免使用任何连接剂。本发明通过将二茂铁功能化多肽修饰到金电极的表面上，并以6-巯基-1-己醇(mch)为封闭剂，制得新型的多肽复合膜修饰电极，既fc-p16peptide/aue。通过循环伏安法(cv)、电化学阻抗谱法(eis)和差分脉冲伏安法(dpv)证实在电极表面形成了l-谷氨酸特异性肽分子的自组装单层(sam)。实验结果证明，多肽复合膜修饰电极对l-谷氨酸具有良好的电化学响应信号，说明多肽复合膜修饰电极在生物传感监测方面具有潜在的应用价值。[0023]总之，本发明设计合成了一种含有iilqenaq氨基酸序列的二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷(fc-p16peptide)，即二茂铁功能化十六肽-3-正丁基-1,2-二硫代环戊烷(fcp16-c4-dtcp)，通过三(2-羧乙基)膦(tcep)还原二硫键将该多肽分子自组装于金电极(aue)表面，并用6-巯基己醇(mch)封闭金表面，获得二茂铁功能化多肽修饰金电极(fc-p16peptide/aue)。通过循环伏安法(cv)、电化学阻抗谱法(eis)和差分脉冲伏安法(dpv)探讨l-谷氨酸在不同修饰电极上的电化学行为，发现fc-p16peptide/aue对l-谷氨酸表现出良好的电化学响应特性。在1mmol/l磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph＝6.5)中，该修饰电极的dpv响应峰电流与l-谷氨酸的浓度在1.0×10-7～1.0×10-3mol/l范围内存在良好的线性关系，检测限为1.0×10-7mol/l。该多肽复合膜修饰电极具有良好的抗干扰性、特异性与实用性，在生命科学与营养健康方面有潜在的应用价值。附图说明：[0024]图1为基于多肽复合膜修饰电极的l-谷氨酸检测传感器的工作结构示意图；[0025]图2为二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷(fc-p16-c4-dtcp，fc-p16peptide)的序列；[0026]图3为不同修饰电极在10.0mmol/l[fe(cn)6]3-/[fe(cn)6]4-(浓度比1：1)-kcl(100.0mmol/l)溶液中的循环伏安图：(a)aue，(b)fc-p16peptide/aue；[0027]图4为不同修饰电极在10.0mmol/l[fe(cn)6]3-/[fe(cn)6]4-(浓度比1：1)-kcl(100.0mmol/l)溶液中的电化学阻抗图：(a)aue，(b)fc-p16peptide/aue；[0028]图5为含有1.0×10-3mol/ll-谷氨酸的pbs1.0mmol/l溶液中，aue和fc-p16peptide/aue的差分脉冲伏安图；[0029]图6为fc-p16peptide/aue对不同浓度l-谷氨酸上的差分脉冲伏安曲线图(a)及峰电流与浓度对数的响应关系曲线图(b)。[0030]图1中：1、银/氯化银电极；2、铂丝电极；3、表面修饰的金电极；4、待测溶液；5、金基质；6、多肽复合膜层；7、多肽分子；8、6-巯基-1-己醇分子；9、l-谷氨酸。具体实施方式：[0031]一、实验过程[0032]1、制备fc-p16peptide/aue多肽复合膜修饰电极[0033]将金电极于超纯水中浸泡，然后抛光，洗净并吹干；将预先配置好的16.0μmol/l的二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷溶液与10.0μmol/l的三(2-羧乙基)膦溶液混匀，室温下静置1h后移液枪移取6.0μl混合溶液，滴加于金电极表面，4℃孵育8h；再将金电极6-巯基-1-己醇浓度为10.0μmol/l的6-巯基-1-己醇溶液中浸泡120min；移液枪移取5％的nafion溶液7.0μl滴加于电极表面，室温自然风干后，用pbs沿着金电极表面缓慢冲洗以除去非特异性吸附的其它物质，吹干即得fc-peptide/aue多肽复合膜修饰电极；[0034]2、l-谷氨酸电化学检测[0035]参见图一，以fc-peptide/aue多肽复合膜修饰电极为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，构成三电极体系；然后采用循环伏安法、电化学阻抗谱法和差分脉冲伏安法考察不同修饰电极的电化学行为，并采用差分脉冲伏安法对不同浓度的l-谷氨酸进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的l-谷氨酸进行检测。[0036]其中，所述表面修饰的金电极3即为本发明所述检测l-l-谷氨酸的传感器中的多肽复合膜修饰电极；所述多肽复合膜修饰电极包括金基质5，所述金基质5表面修饰有多肽复合膜层6，所述多肽复合膜层6中含有多肽分子7和6-巯基-1-己醇分子8，所述多肽分子7为二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷分子(fc-p16peptide)，即二茂铁功能化十六肽-3-正丁基-1,2-二硫代环戊烷(fc-p16-c4-dtcp)，所述二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷分子的氨基酸序列为ggggiilqenaqgggg，两端的-gggg-为连接序列(linker)。所述金基质5的厚度为1.0～5.0mm，所述多肽复合膜层6的厚度为2～20nm。[0037]3、样品处理与测定[0038]采用标准加入法对小鼠血清样品(待测溶液4)中l-谷氨酸进行检测。小鼠血清样品(来源于5只活体小鼠，体重约0.25㎏)由中国科学院亚热带农业生态研究生(长沙)提供。分别将5种不同的小鼠血清样品50.00μl加入ph＝6.5的pbs缓冲溶液(4.950ml)中稀释100倍，再向小鼠血清溶液中加入不同浓度的l-谷氨酸，采用dpv进行测定。[0039]二、实验结果与分析[0040]1、l-谷氨酸在电极表面的电化学行为[0041]通过循环伏安法和电化学阻抗谱法测量以观察多肽复合膜修饰电极的组装情况，从图3和图4可以发现在10.0mmol/l[fe(cn)6]3-/[fe(cn)6]4-(1：1)-100mmol/lkcl溶液中，裸金电极(aue)处观察到了一对十分明显的氧化还原峰，同时，阻抗图半径最小，说明在裸金电极上存在快速的电子转移；与裸金电极(aue)相比，fc-p16peptide/aue电极处不易观察到明显的氧化还原峰且阻抗图半径明显增大。显然，当二茂铁功能化十六肽二硫代环戊烷(fc-p16-c4-dtcp，fc-p16peptide)组装到金电极上之后，形成的多肽复合膜阻挡了电极表面与溶液的电子传递，电极表面电阻增大，因此其电流值下降很大。[0042]图5考察aue、fc-p16peptide/aue在含有谷氨酸的1mmol/l的pbs溶液差分脉冲伏安(dpv)行为。由图5可知，l-谷氨酸在aue电极上的还原峰不明显，说明l-谷氨酸在aue表面较难被还原；而相对于aue来说，fc-p16peptide/aue电极对l-谷氨酸的响应增强，响应峰电流增大了，说明fc-p16peptide/aue电极上的多肽分子能够很好地结合l-谷氨酸。[0043]2、线性范围和检出限[0044]在优化的实验条件下，fc-p16peptide/aue电极通过差分脉冲伏安法对不同浓度的l-谷氨酸进行检测(图6)，从图中我们发现，当l-谷氨酸的浓度从1.0×10-7mol/l升到1.0×10-3mol/l的过程中，响应峰电流在稳定地增加(图6)，这说明当越来越多的谷氨酸结合到多肽上后，减小了金电极表面与二茂铁之间的空间位阻，电子传递效率降低。浓度在1.0×10-7mol/l～1.0×10-3mol/l范围内呈现出良好的线性关系，线性方程为i＝1.22036+0.15718lgc，相关系数r2＝0.9936，检测下限为1.0×10-7mol/l；将本发明制备的fc-p16peptide/aue电极与其它文献报道的l-谷氨酸电极进行比较(见表1)，可以发现本发明所制备电极具有更加优异的性能。[0045]table1comparisonofperformancewithdifferentmodifiedelectrodes[0046]technol57,69-77.[0056]d,y.l.,andkaraku,e.(2011).constructionofapotentiometricglutamatebiosensorfordeterminationofglutamateinsomerealsamples.artifcellsbloodsubstitimmobilbiotechnol39,385-391.[0057]deng,y.,wang,w.,ma,c.,andli,z.(2013).fabricationofanelectrochemicalbiosensorarrayforsimultaneousdetectionofl-谷氨酸tamateandacetylcholine.jbiomednanotechnol9,1378-1382.[0058]ghorai,a.,mondal,j.,chandra,r.,andpatra,g.k.(2015).exploitationofasimpleschiffbaseasaratiometricandcolorimetricchemosensorforglutamicacid.analyticalmethods7,8146-8151.[0059]lin,x.,wang,q.,zhu,s.,xu,j.,xia,q.,andfu,y.(2016).ahighlysensitiveglutamicacidbiosensorbasedonthedeterminationofnadhenzymicallygeneratedbyl-谷氨酸tamicdehydrogenase.rscadvances6,45829-45834.当前第1页12当前第1页12